Часто задаваемые вопросы

Олигонуклеотиды стабильны в водном растворе при температуре 25ºС в течение 1 - 2 недель при концентрации выше 150 нг/мкл (20 мкмоль). РЕКОМЕНДУЕТСЯ для большей сохранности олигонуклеотидов хранить их при -20 ºС. НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ часто размораживать/замораживать олигонуклеотидов, если их концентрация ниже 100 нг/мкл (15 мкмоль). Олигонуклеотиды с флуоресцентной метки следует хранить только в темноте. НЕ ДОПУСТИМ контакт олигонуклеотидов с нестерильными предметами, особенно при работе с ферментами и агрессивными средами. ВНИМАНИЕ! Разбавление и замораживание олигонуклеотидов при концентрации ниже 15 мкмоль может стать причиной снижения качества олигонуклеотида при ПЦР.

Для стандартных олигонуклеотидов рекомендуется проводить:
Систематический визуальный контроль - раствор должен быть прозрачным без видимого осадка.
Спектрофотометрический анализ и определение концентрации.
Анализ олигонуклеотидов с использованием обращенно-фазовой или ион-парной ВЭЖХ с предоставлением профиля разделения (по требованию).
ПААГ электрофорез с использованием маркеров длин.
Для модифицированных олигонуклеотидов рекомендуется контролировать присутствие модификаторов:
Для олигов с флуоресцентной меткой необходимо контролировать присутствие метки с помощью ПААГ электрофореза с последующей визуализацией продукта под УФ-лампой.
Для олигов с биотином необходимо контролировать присутствие биотина в олигонуклеотиде с использованием как электрофоретического, так и колориметрического анализа.
Для олигов с аминогруппой необходимо контролировать присутствие аминогруппы по реакции с биотином.
Для олигов с фосфатной группой необходимо контролировать присутствие фосфатной группы по гидролизу аликвоты модифицированного олигонуклеотида щелочной фосфатазой с последующим электрофоретическим анализом продуктов реакции.

Оптическая плотность в О.Е., молекулярная масса (M.W.) и объем (V) могут быть приведены в паспорте продукта или отчете по синтезу. Эта информация может быть использована для расчета концентрации образца в любых желаемых единицах. Если нужно знать концентрацию в микрограмм на мл, умножьте значение оптической плотности на 33 (коэффициент экстинкции) и разделите его на объем в милилитрах.
Формула: Микрограмм / миллилитр = O.Е. х 33/ V (в миллилитрах)
Например, если имеется 28 O.Е. в 500 микролитрах воды, расчет будет следующим: 28х 33 / 0,5 = 1848 микрограмм / миллилитр. Чтобы выяснить концентрацию в микромолях, следует разделить полученное количество в микрограммах на молекулярную массу (M.W.) и объем (V) образца в литрах.
Формула: μM = O.Е.х 33 /M.W. (g) / V (L) Например, если образец имеет 28 O.Е. в 500 микролитрах, а молекулярный вес составляет 9000 грамм, расчет будет следующим:28 х 33/9000 / 0,0005 = 205,33 микромоль на литр. Если нужно знать концентрацию в микромолях на мл, расчет выполняется по формуле: 28 х 3/9000 / 0,5 = 0,205 микромоль / милилитр.
Значение O.Е. не имеет единиц и не зависит от объема раствора. Чтобы вычислить количество микрограммов в образце олигонуклеотидов, умножьте значение OD на константу, называемую коэффициентом молекулярной экстинкции. Коэффициент молекулярной экстинкции для каждого олигонуклеотида незначительно отличается, но 33 обычно используется в качестве приближенного значения экстинкции для одноцепочечной ДНК.

Олигонуклеотиды имеют гидроксильные группы на 3’ и 5’ концах, фосфатных групп не имеют. Но возможна такая модификация.

Внешний вид высушенных олигонуклеотидов может отличаться из-за небольших изменений, которые обычно происходят в условиях сушки. Внешний вид может варьироваться от стеклянного шарика небольшого размера до относительно большой белой гранулы. Перед вскрытием все пробирки для образцов должны быть отфугованы на центрифуге, чтобы предотвратить потерю продукта, который мог быть диспергирован на стенках пробирки.

Масштаб синтеза определяется количеством исходного материала (например, масштаб 50 наномоль означает, что имеется 50 наномоль начального основания на полимере, используемого для синтеза.) Из исходного материала значительная доля может быть недоступна для использования из-за химической модификации или стерических проблем. Фактический выход рассчитывается так, как описано выше.

Длина определяется пределом разрешения метода очистки и эффективности присоединения, обеспечиваемого ДНК-синтезатором. На данный момент можно синтезировать олигонуклеотиды длиной до 200 и более оснований и получать достаточно высокие выходы путем очистки ПААГ для успешной конструкции генов. Следует помнить, что чем больше длина, тем больше вероятность накопления ошибок в последовательности.

Многие из модифицированных амидитов нестабильны и имеют более низкую эффективность присоединения в сравнении с немодифицированными основаниями. Все модифицированные олигонуклеотиды следует очищать либо с помощью RP-картриджа, либо с помощью ВЭЖХ, для более эффективного удаления нецелевых последовательностей. Продукт теряется также в результате очистки, но конечный продукт, хотя и с более низким выходом, намного чище.

Ограниченная стабильность реагента (менее 48 часов) и низкая эффективность присоединения реагента требуют использования избыточного модифицирующего реагента для получения достаточного количества продукта, что обуславливает высокую стоимость синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

Да, стандартные протоколы синтеза предусматривают возможность синтеза вырожденных олигонуклеотидов.

Для проведения реакции лигирования требуется наличие фосфатной группы на 5’-конце. Если олигонуклеотиды не содержат данную группу на 5’-конце, лигирования не произойдет. Проблема может быть решена фосфорилированием олигонуклеотида ферментативно с помощью киназы перед использованием в реакциях лигирования.

Очищенная вода, натрий-фосфатный буфер или любые другие биологические буферы приемлемы в качестве разбавителей. Рекомендуемый объем разбавителя составляет 100 мкл - 1 мл, концентрация зависит от применения и выхода полученного продукта. Стандартная концентрация для ПЦР-праймеров составляет 0,1 миллимоль.

Конечный выход (количество) олигонуклеотида можно определить через два коэффициента пересчета. Первый - наномоль на единицу оптической плотности (о.е.). Второй - микрограммы на единицу оптической плотности (о.е.) Оптическая плотность измеряется на спектрофотометре при длине волны 260 нанометров. Чтобы найти конечный выход в наномолях перемножьте оптическую плотность измеряемого олигонуклеотида и коэффициент конверсии оптической плотности в наномоли. Чтобы найти конечный выход в микрограммах перемножьте оптическую плотность измеряемого олигонуклеотида и коэффициент конверсии оптической плотности в микрограммы.

Лиофилизированные (подвергнутые лиофильной осушке) олигонуклеотиды достаточно стабильны при комнатной температуре, по крайней мере в краткосрочном периоде. Но в долгосрочном периоде необходимо, чтобы олигонуклеотиды хранились в сухом виде при -70 ° С.

Не рекомендуется хранить олигонуклеотиды в растворе при -20 ° С. Циклы замораживания и оттаивания могут привести к деградации олигонуклеотидов. Замораживание и оттаивание допустимы, когда олигонуклеотиды удаляются из морозильника, а затем помещаются обратно после использования. К сожалению, также могут возникнуть непреднамеренные циклы замораживания / оттаивания. Наиболее частыми причинами являются морозоустойчивые морозильники и колебания температуры в морозильной камере.

Олигонуклеотиды могут быть растворены либо в стерильной воде, либо в буфере. Мы рекомендуем растворить олигонуклеотиды, затем аликвотировать на несколько пробирок и рабочие растворы (аликвоты) следует хранить при 4° С. Остальные аликвоты следует лиофилизовать (высушить с использованием лиофильной сушки) и хранить высушенные пробы (олигонуклеотидные гранулы) в холодильнике при -70° С. В этих условиях олигонуклеотиды в виде высушенных гранул могут храниться долго. Жидкие олигонуклеотиды обычно стабильны в течение недели при условии хранения при температуре 4° С.

Применительно к олигонуклеотидам термин «обессоливание» означает удаление небольших молекул органических примесей, которые являются побочными продуктами синтеза. Единственной солью является сама ДНК. Отрицательный заряд фосфатного скелета олигонуклеотида компенсируется положительно заряженным противоионом для поддержания электрической нейтральности (обычно используются ионы аммония). Пост-синтетическая обработка включает в себя удаление защитных групп путем инкубации в аммиаке или другом базовом реагенте. Продукт может быть очищен для удаления отщепленных базовых защитных групп и других побочных продуктов синтеза. Этот процесс обычно называют обессоливанием. Для проведения стандартных ПЦР реакций олигонуклеотиды не нуждаются в обессоливании. Для проведения киназной реакции обессоливание олигов необходимо.

Эффективность присоединения каждого нового основания (мономера) обычно составляет 99% и более.

После первой стадии присоединения объем диметокситритильной защитной группы (ДМТ, Тритила), который появляется во время деблокирования, прямо пропорционален количеству полноразмерного олигонуклеотида, полученного в предыдущем цикле. Снимаемая диметокситритильная защитная группа имеет оранжевый цвет, интенсивность этого цвета может быть измерена с помощью УФ-спектрофотометрии. Сравнивая интенсивность окраски, полученные после первой и последней операций присоединения, можно рассчитать эффективность присоединения или качества синтеза.

Фосфоамидитовые мономеры (амидиты) имеют на 5'-конце с диметокситритильную защитную группу. Эта группа связанного с носителем мономера удаляется в процессе операции деблокированя на каждом цикле синтеза. Конечная диметокситритильная защитная группа остается или удаляется, в зависимости от выбранного метода очистки. Если будет выполнятся очистка с использованием RP-картриджа или ВЭЖХ, необходимо не удалять конечную защитную группу, если же требуется очистить олигонуклеотиды с помощью электрофореза с использованием полиакриламидного геля (ПААГ), то конечную ДМТ-защиту нужно удалить.